近期，UCSF的AdamAbate团队在AdvancedMaterials期刊上发表了“HighDefinitionSingleCellPrinting:CellbyCellFabricationofBiologicalStructures”的文章。
摘要：生物打印是一项强大的技术，具有改变医疗设备制造，器官替代以及疾病和生理畸形治疗的潜力。但是，当前的生物打印机无法可靠地打印所有生物的基本单元，即单细胞。本文介绍了一种高清晰度的单细胞打印技术，它是一种新颖的微流控技术，可以准确地打印多种候选对象中的单个细胞。该生物打印机采用高度微型化的微流分选机确定性地选择感兴趣的单个细胞进行打印，从而实现了≈10m的精度和≈Hz的速度。通过选择性的单细胞打印制作具有预定义功能的复杂细胞图案，证明了这种方法。该方法用于合成成分和形态受控的定义明确的球体。该方法的速度，准确性和灵活性将推动生物打印的发展，从而使类器官科学，组织工程学和空间靶向细胞疗法的新研究成为可能。
单细胞打印原理
组装具有可控细胞尺度特性的生物结构的当前方法依赖于介导细胞相互作用。例如，这可以通过使用DNA控制细胞聚集或将DNA印刷到基质上以将细胞分组到所需位置来实现。但是，用这些方法构造复杂的多层结构尚未完成。一种从细胞生成精细结构的方法是将3D打印的灵活性与荧光激活细胞分选（FACS）的细胞选择性结合起来。然而，将细胞选择性整合到生物打印中的方法笨拙且缓慢，而流式细胞仪则缺乏以微米分辨率分配细胞的精度。用FACS限制精确细胞打印的主要挑战是其大型分选机带有带电的静电板，从而无法使分选机出口靠近基材。因此，本研究的核心创新是一种小型化的细胞分选仪，该分选仪可实现FACS的速度和选择性，同时又足够小，几乎可以与基材接触。从分选机到基板，打印的单元仅移动≈3mm，提供的精度为≈10m（图1）。通过将此细胞分选仪与3D打印组件（包括机械平台）结合使用，并使用计算机控制系统，可以打印高分辨率结构。基质在x–y平面上的定位由机械平台控制，从而使计算机可以将细胞分选与基质对齐。为了打印所需的结构，我们向计算机提供了将单元类型分配给每个基板“像素”的指令。计算机逐个像素地遍历基板，分配所需的单元格。
图1单细胞打印原理为了选择性地打印细胞，用荧光染料标记细胞，使其能够通过流式细胞术测量来识别。雾化是通过在集中的气流中剪切细胞悬浮液而发生的，从而产生包含单个细胞的单分散液滴。这种设计可实现直径受控的均匀液滴。随空气和水的流速变化，研究者使用30×30m喷嘴产生直径36至50m的液滴，使用70×70m喷嘴产生直径至m的液滴。因为研究者使用顺流几何形状，所以在“滴落”状态下运行时会形成单分散的液滴。生成后，聚集的空气使液滴加速通过光学检测器，该检测器会扫描液滴中的细胞（图2）。荧光信号由四色检测器实时分析，并根据预定义的门控参数对细胞进行分类。由于将所需细胞从混合悬浮液中选出后，就可以将分选视为将特定细胞按需递送至给定位置的策略。
传统的流式细胞仪中，细胞分选是通过液滴的带电和电场偏转来实现的。然而，这些仪器无法在精确的细胞印刷所需的紧凑空间中实现足够的细胞偏转。因此，研究者开发了一种基于介电电泳的新型细胞分选机制，该机制利用了导电液滴与绝缘周围环境之间的介电常数差异。通过改变施加的电压可以调节介电泳的液滴偏转。因此，电极通电可在偏转的液滴路径（图2b中的电极接通）或笔直的液滴路径（图2c中的电极断开）之间切换。因为分类的目的是分配某些液滴并丢弃所有其他液滴，所以偏转的液滴不得撞击基材。为了确保这一点，研究者在电极的下游包括一个真空通道（图2a）。真空不会改变未偏转液滴的运动，但是会捕获偏转的液滴（图2b）。
图2单细胞打印的分选和实现00:25单细胞喷射能力检验
通过分选系统，可以将喷射的含细胞率由10%提升至95%。总体而言，使用研究者目前的仪器可以在≈50Hz的频率下进行精确的单细胞打印，以这种速率，可以在≈40分钟内打印出由20m单元组成的1立方毫米构造。并可以实现不同荧光细胞的分选，实现多细胞的按结构/设计的打印制造。同时，结果说明分选过程温和并且不会显着降低细胞活力或增殖。
图3墨水的流变特性打印精度和组合打印能力
在阵列上打印定义的细胞组合对于在细胞生物学和筛选中的应用很有用，但是可用的生物打印机缺乏在精确位置打印细胞组合的能力，并且不能包含特定数量的不同细胞类型。而研究者的方法可以准确地打印大型和复杂的细胞阵列。
对于3到5mm的打印距离，获得的平均精度约为≈8m。并可以打印条件更系统地变化的更复杂的阵列，例如每个点交替五个单元，以及红色和绿色单元组成的线性变化（图4c）。通过机械平台可以通过更精细，更复杂的运动范围进行平移，从而可以打印任何2D图案。研究者了打印具有相同轮廓但细胞密度不同的“UCSF”（图4d）。要打印多色图像，我们用不同的染料对细胞染色，并打印不同颜色的个单元的正方形（图4e）。通过2D图案的逐层打印，可以生成3D结构（图4f）。这种基本能力允许制造由受控细胞类型组成的空间异质结构。作为最后的演示，研究者从绿色单元格中打印出一个高约2毫米的埃菲尔铁塔（图4g）；该图像的分辨率大约是标准喷墨打印机的十倍。
图4墨水的打印性能类器官球体的构建
多细胞球体提供了生理学的3D微环境，并且正在成为类器官研究和组织工程构建模块的有用模型。但是，现有的产生球体的方法缺乏控制。标准方法是将细胞大量混合并随机聚集。但是，这将对成分的控制降到最低，并生成极其不均匀的球体。或者，可以通过聚集孔中的细胞并利用限制约束组装来提高均匀性。以相似原理操作的微流体方法产生相似的结果。尽管这些方法比本体形成要好，但由于聚集是随机的，并且产生具有随机组合的椭球，因此这些方法对组成的控制最小。此外，这些方法无法控制3D架构。
构建具有可控成分（包括细胞数量，细胞类型比率和3D形态）的球体的能力将代表其制造的重大进步。它不仅将提供用于研究和临床使用的高质量球体，而且还可以自定义其属性。例如，具有特定数量的不同细胞的球体对实验条件或药物的反应可能不同，而具有不同3D结构的球体可能更好地模仿它们打算建模的非球形组织。因为我们的方法是逐个细胞地构建结构，所以它提供了构建具有均匀大小，精确数量和类型的细胞以及受控3D架构的球体所需的控制。为了说明这些功能，我们对具有受控数目的起始细胞的球体进行生物打印（图5a）。以相同数量的起始细胞（图5b）印刷的球体之间具有显着的均匀性，并且最终大小与初始细胞数紧密相关（图5c，d）。的确，=打印机的单细胞性质允许用以前不可能的方式可靠地制造球体，包括从1个，5个和10个起始细胞。结果说明了使用逐个细胞组装来构建具有新颖架构的球体的潜力。以前不可能对不同的起始条件进行球体组件的系统研究，因此，目前对球体如何影响最终结构的了解有限。因此，单细胞打印可用作生成受控球体的制造平台，并用作测试床以研究如何通过控制初始细胞组成来设计其特性。
图5可控的球体打印展望
单细胞打印机可以像流式细胞仪一样用于分离斑点或孔的网格中的单细胞和多细胞组合。微米分辨率可实现高密度打印，目前商业分选机不支持的格式，包括孔板，甚至密度更高的定制板。此外，这种受控分配应在单细胞多峰分析中提供新的机会，因为印刷细胞可以进行培养，成像，光谱学和基于阵列的单细胞测序。确实，流式细胞术中使用的技术应立即可用。例如，通过光散射，高光谱成像和实时成像进行细胞鉴定将无需预先标记即可进行鉴定。虽然这些方法在应用于未知人群时通常会失败，但打印机使用了已知的悬浮液细胞类型，使用这些无标签方法更容易实现准确识别。消除对荧光标记细胞的需求将简化印刷工作流程，并在印刷结构的设计中提供更大的灵活性。
打印机为生物材料制造提供了独特的机会。快速准确的单细胞打印可以组装新颖的球体结构。通过包括颗粒和水凝胶基质，将可能形成具有包括空隙和功能性颗粒的受控结构的球体。椭球体已经是研究和药物筛选中的宝贵工具，具有先进功能的可再现性构建它们的能力将使新的研究和应用成为可能。例如，受控组装允许研究起始构型如何影响最终结构，这应该产生关于细胞如何协调产生多细胞结构的见解。同样，打印机应与真核和原核细胞兼容。这些细胞的组装应允许研究微生物如何协作以在各种环境中生存，鉴定可培养的细胞最少或研究生物膜和人类微生物组中的细胞相互作用。
研究者的方法的一个有趣的应用是原位细胞印刷，即将细胞或功能颗粒直接印刷到活组织上。小尺寸的打印头可以实现这一点，从而可以将其插入受限的空间并打印到任何基材上。但是，到目前为止，关于此过程如何促进组织发育或愈合的研究很少，因为从未有过如此快速，准确和紧凑的单细胞打印机。因此，研究者的平台在推进这一研究前沿方面应该是有用的。
参考文献
Zhang,P.,Abate,A.R.,HighDefinitionSingleCellPrinting:CellbyCellFabricationofBiologicalStructures.Adv.Mater.,.
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