全蛋白胞嘧啶碱基编辑器DdCBE使用TALE蛋白和双链DNA特异性胞苷脱氨酶(DddA)介导靶向CG到TA编辑。
年4月4日，博德研究所刘如谦团队在NatureBiotechnology在线发表题为“CRISPR-freebaseeditorswithenhancedactivityandexpandedtargetingscopeinmitochondrialandnuclearDNA”的研究论文，该研究为了提高编辑效率并克服DddA严格的TC序列约束，使用噬菌体辅助的非连续和持续进化来进化具有改进活性和扩大靶向范围的DddA变体。
与经典的DdCBE相比，具有进化DddA6的碱基编辑器将TC的线粒体DNA(mtDNA)编辑效率平均提高了3.3倍。含有进化的DddA11的DdCBE为线粒体和核碱基编辑提供了更广泛的HC（H=A、C或T）序列兼容性，将AC和CC靶标的平均编辑效率从标准DdCBE的不到10%提高到15-30%。该研究使用这些进化的DdCBE在非TC靶位点有效地在人类细胞中安装与疾病相关的mtDNA突变。DddA6和DddA11大大提高了全蛋白碱基编辑的有效性和适用性。
另外，年3月18日，中国农业科学院深圳农业基因组研究所左二伟、中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心杨辉、上海脑科学与类脑研究中心/临港国家实验室胥春龙、上海交通大学章美玲共同通讯在CellDiscovery（IF=11）在线发表题为“MitochondrialbaseeditorDdCBEcausesubstantialDNAoff-targeteditinginnucleargenomeofembryos”的研究论文，该研究使用GOTI方法（点击阅读），以评估DdCBE对mtDNA和核DNA修饰的脱靶效应。该研究首次展示了DdCBE在整个核基因组中导致数千个脱靶SNV，这些SNV富含C-to-T/G-to-A转换，这是低保真碱基编辑器BE3产生的SNV数的两倍。总之，该研究发现DdCBE对核基因组具有广泛的脱靶效应，强烈需要优化DdCBE以在mtDNA上进行特定的碱基编辑，特别是在用于治疗线粒体疾病之前（点击阅读）。年2月1日，上海交通大学章美玲，李文及中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心杨辉共同通讯在CellDiscovery在线发表题为“Humancleavingembryosenableefficientmitochondrialbase-editingwithDdCBE”的研究论文，该研究表明，DdCBE是一种有效的碱基编辑器，可在人类胚胎mtDNA中诱导点突变，并且在8细胞胚胎中的效率要高得多。鉴于旁观者和脱靶编辑特征，DdCBE仍有待进一步优化用于未来的基础和治疗研究。年2月1日，南京医科大学许争锋、沈斌及凌秀凤共同通讯在CellDiscovery在线发表题为“DdCBE-mediatedmitochondrialbaseeditinginhuman3PNembryos”的研究论文，该研究首次证明了在人类3PN胚胎中进行DdCBE介导的线粒体碱基编辑的可行性，表明在人类早期胚胎阶段进行致病性mtDNA突变校正的可能性。理论上，DdCBE可以纠正mtDNA中的一系列致病性AT-to-GC突变，从而达到治疗效果。尽管在3PNmtDNA中检测到的脱靶编辑可能不足以产生表型，但当前的线粒体碱基编辑策略需要进一步优化以满足任何临床应用的需求。年7月8日，博德研究所DavidR.Liu及华盛顿大学医学院JosephD.Mougous共同通讯在Nature在线发表题为“AbacterialcytidinedeaminasetoxinenablesCRISPR-freemitochondrialbaseediting”的研究论文，该研究描述了一种细菌间毒素，将其命名为DddA，它可以催化dsDNA中胞苷的脱氨。该研究设计了无毒且无活性的split-DddA半分子：DddA分割的一部分结构域（转录激活子样效应子阵列蛋白）和尿嘧啶糖基化酶抑制剂的融合，产生了无RNA的DddA衍生的胞嘧啶碱基编辑器（DdCBE），可催化人mtDNA中的CG到TA转化，具有高靶标特异性和产品纯度。该研究使用DdCBEs建模人类细胞中与疾病相关的mtDNA突变，从而导致呼吸速率和氧化磷酸化的改变。不含CRISPR的DdCBE可以精确操纵mtDNA，而不是消除因被靶向核酸酶切割而产生的mtDNA拷贝，这对线粒体疾病的研究和潜在治疗具有广泛的意义（点击阅读）。每个人类细胞可以包含数百个环状mtDNA拷贝，这些环状mtDNA编码RNA和介导ATP产生的蛋白质。由于线粒体在能量稳态中的重要作用，mtDNA中的单核苷酸突变可导致发育障碍、神经肌肉疾病、癌症进展和越来越多的其他人类疾病。能够在mtDNA中精确安装点突变的技术可以揭示这些突变在发病机制中的作用，并为潜在的治疗应用提供纠正它们的方法。
可编程核酸酶可以在含有特定突变的mtDNA拷贝中进行靶向双链断裂，从而消除这些拷贝。然而，核酸酶不能引入特定的序列变化。基因组编辑器，包括碱基编辑器和先导编辑器，直接在目标DNA序列中安装精确的变化，但通常依赖于引导RNA序列来引导CRISPR-Cas蛋白与其目标DNA结合。由于将引导RNA导入线粒体的挑战，迄今为止，基于CRISPR的系统尚未可靠地用于mtDNA工程。
为了应对这一挑战，最近开发了DdCBE，以在mtDNA内实现有针对性的CG到TA转换。DdCBE使用两个TALE蛋白来指定用于编辑的双链DNA(dsDNA)区域。每个TALE都与无毒的一半DddA和一份尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)蛋白融合。两个TALE融合的分裂-DddA-UGI融合体与相邻位点的结合促进了功能性DddA的重新组装，以使dsDNA间隔区域内的靶胞嘧啶脱氨基。DdCBE已应用于人类胚胎、小鼠、斑马鱼和植物的线粒体碱基编辑。
噬菌体辅助进化DddA衍生的胞嘧啶碱基编辑器以提高活性和扩大靶向范围（图源自NatureBiotechnology）
在该研究中观察到一系列mtDNA编辑效率（4.6-49%），这取决于目标C在DNA结合的DdCBE两半之间的间隔区域内的位置。研究人员假设通过提高DddA与不同TALE设计和脱氨酶方向的兼容性，增强分裂DddA的活性可以提高假定的5-TC环境下的mtDNA编辑效率。
鉴于DddA的严格序列偏好，最初的DdCBE主要限于TC靶标。在这项研究中，试图通过应用快速噬菌体辅助连续进化(PACE)和相关的噬菌体辅助非连续进化(PANCE)方法来增加TC和非TC靶标的DdCBE活性。DdCBE活性选择的开发，导致了几种DddA变体，这些变体在进化过程中具有丰富的保守突变。
与野生型DddA相比，进化变体DddA6和DddA11介导了TC靶标的mtDNA碱基编辑效率平均提高了约4.3倍。值得注意的是，DddA11将mtDNA和细胞核中AC和CC靶标的平均批量编辑水平从标准DdCBE的不到10%提高到~15-30%。这些变体共同能够在TC和非TC目标上安装或校正CG到TA点突变，从而大大扩展了DdCBE的整体效用。
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